Tóm Tắt
Tại sao cần định type HPV
Virus HPV (Human Papilloma virus – HPV) thuộc họ Papillomaviridae được lây truyền qua đường tình dục và những nơi có tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nguồn bệnh. Có nhiều hơn 100 type HPV là nguyên nhân gây bệnh liên quan đến bệnh lý da và niêm mạc và khoảng 40 type có tác động lên đường sinh dục, đặc biệt liên quan đến bệnh lý ung thư cổ tử cung. Nhóm được gọi là nguy cơ cao bao gồm các type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 66 ,68. Trong đó type 16,18 chiếm 70% nguy cơ gây ung thư cổ tử cung, 5% nguy cơ gây ung thư còn lại nằm ở các chủng nguy cơ cao khác. còn lại Các type HPV-6, 11, 42, 43, 44 được gọi là nhóm nguy cơ thấp chỉ gây mụn cóc sinh dục.
Một trong những xét nghiệm sàng lọc ung thư cổ tử cung là xét nghiệm định type virus HPV. Việc sàng lọc HPV định kì được Hiệp hội Phụ sản Hoa Kì khuyến nghị như sau :
Giới thiệu về lai điểm ngược
Với ưu điểm nổi bật cho phép phát hiện được nhiều đột biến trong cùng một lần thực hiện, phương pháp lai điểm ngược đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để phát hiện đột biến của 1 loại bệnh như β-thalassemia, đột biến kháng thuốc lao, định type HPV,… Tại Việt Nam, kỹ thuật này cũng đã được ABT áp dụng để sản xuất bộ TopSENSI® HPV GENOTYPE RDB KIT nhằm xác định sự đồng nhiễm của 32 chủng HPV phổ biến tại việt Nam (Human papillomavirus). Trong đó bao gồm:
Bộ kit có năng lực nhận diện 35 genotype HPV gồm có :
- 12 genotype HPV rủi ro tiềm ẩn cao : 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 .
- 10 genotype HPV có năng lực rủi ro tiềm ẩn cao : 26, 34, 53, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 82 .
- 13 genotype HPV rủi ro tiềm ẩn thấp : 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 64, 71, 72, 81, 83 .
-
Nguyên lý
-
Màng lai
Màng màng nylon Biodyne C tích điện âm. Các nhóm carboxyl trên màng được hoạt hóa bằng EDC ( 1 – ethyl-3-dimethylamino propyl carbodiimide hydrochloride ) thành dạng O-acylurea. Dạng chất trung gian này lập tức phản ứng với nhóm amin trên đầu dò oligo thành link amide .
Các nhóm carboxyl sau khi đã được hoạt hóa hoàn toàn có thể phản ứng với bất kỳ tác nhân nào có trong dung dịch. Việc bám không đặc hiệu này trải qua những thương tác tĩnh điện, kị nước hoặc tương tác hóa học đều hoàn toàn có thể làm giảm đáng kể độ nhạy của kỹ thuật lai .
Do đó, đầu dò oligo sau khi đã được cố định và thắt chặt trên màng, cần bất hoạt toàn bộ những nhóm đã hoạt hóa nhưng không gắn oligo. Dung dịch NaOH 0,1 N thường được sử dụng cho quy trình này do tính hiệu suất cao và đơn thuần. Màng sau khi hoạt hóa được dữ gìn và bảo vệ trong thiên nhiên và môi trường tránh ẩm .
Đầu dò được cố định trên màng lai là một phân tử axit nucleic sợi đơn có ái lực mạnh với trình tự gen mục tiêu. Đầu dò oligonucleotide gắn đặc hiệu với tự đích. Chiều dài của chúng phù hợp cho phản ứng lai trong các điều kiện ngặt nghèo, giúp phân biệt ADN với những sai khác rất nhỏ trong trình tự. Việc thiết kế đầu dò dựa trên các đặc điểm sau [28]:
– Kích thước phổ cập là 18-30 nucleotide 19
– Thành phần G + C từ 40-60 % để tăng năng lực lai đặc hiệu
– Không có những trình tự bổ trợ bên trong đầu dò để tránh hình thành cấu trúc “ kẹp tóc ” ( hair-pin ), ngăn cản quy trình lai
– Tránh trình tự có nhiều hơn 4 nucleotide lặp lại
– Không sử dụng đầu dò có độ tương đương > 70 % với những vùng không phải trình tự đích để tránh hiện tượng kỳ lạ lai không đặc hiệu. Đầu dò cho kỹ thuật lai điểm ngược thường được gắn thêm nhóm amin vào đầu 5 ′ .
Sản phẩm PCR
- Sản phẩm PCR ghi lại với biotin. Trong tự nhiên, tương tác giữa biotin và streptavidin là tương tác sinh học không cộng hóa trị mạnh nhất ( hằng số phân ly Kd = 10-15 ) [ 17 ] .
Hoạt hóa và cố định đầu dò trên màng nylon Biodyne C
– Rửa màng với dung dịch HCl 0,1 N trong 3 phút
– Chuyển màng vào dung dịch EDC 16 %, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng 15 phút
– Để khô màng ở nhiệt độ phòng
– Đầu dò oligo được pha loãng đến nồng độ tối ưu trong đệm NaHCO3 / Na2CO3 0,5 M, pH 8,4
– Chấm 1 µl đầu dò đã pha loãng lên màng, để khô 10 phút
– Cố định bằng NaOH 0,1 N trong 10 phút
– Rửa màng 2 lần với H2O
– Để khô và dữ gìn và bảo vệ ở 4 oC hoặc dùng màng lai ngay .
Thành phần hóa chất
Thành phần hóa chất
|
NaOH | Sử dụng để làm biến tính DNA pH [ 25-29 ]. Ở pH kiềm, những nhóm OH – chiếm lợi thế. Chúng vô hiệu những proton tạo ra link hydro khỏi guanin và thymine, do đó phá vỡ những link hydro giữa hai oligonucleotide . |
|
|
Tạo môi trường tự nhiên ion tương thích cho phản ứng lai . |
|
Kết tủa trong điều kiện kèm theo lạnh cần phải dã đông trước khi sử dụng. SDS khiến mạch DNA đơn duỗi ra làm giảm cấu trúc bậc 2 để đoạn gen thuận tiện lai vào mẫu dò . | |
| Nước cất 2 lần . | Tạo thiên nhiên và môi trường thích hợp để đoạn gen đích lai với mẫu dò đã được cố định và thắt chặt trên màng lai đồng thời rửa trôi những link không đặc hiệu . | |
|
Streptavidin-HRP | – Streptavidin có ái lực cao với phân tử biotin. Streptavidin HRP là một cộng hợp protein streptavidin phối hợp với HRP . – HRP là 1 peroxidase enzyme. Tùy thuộc vào cơ chất mà phản ứng giữa enzyme HRP và cơ chất sẽ tạo ra sắc tố khác nhau . |
|
– Tris-HCl 0,1 M pH 9,5 – NaCl – MgCl2 |
– Là thiên nhiên và môi trường thích hợp để phản ứng hiện màu diễn ra . – Đảm bảo pH thích hợp và cung ứng cofactor Mg + cho enzyme hoạt động giải trí . |
|
TMB |
– TMB là cơ chất của Streptavidin-HRP. Khi TMB link với Streptavidin-HRP sẽ tạo ra phản ứng màu xanh . – TMB rất nhạy cảm với ánh sáng do đó cần tránh ánh sáng khi triển khai thao tác với TMB . – Không để nắp chai dữ gìn và bảo vệ mở trong thời hạn lê dài vì TMB nhạy cảm với những tác nhân oxi hóa . – TMB bị đóng đá trong điều kiện kèm theo lạnh. Cần chú ý quan tâm rã đông trọn vẹn trước khi hút . |
Nguồn: Tổng hợp
Mời bạn xem thêm sản phẩm tại đây: >>> Kit định type HPV bằng phương pháp RDB <<<
Công ty TNHH Thiết bị ABT chúng tôi luôn tự tin và tự hào với đội ngũ nhân viên có nhiều năm kinh nghiệm về lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là các xét nghiệm liên quan đến xét nghiệm bệnh virus, vi khuẩn trên người, thực phẩm, thủy sản, thú y…Nếu có bất kì thắc mắc hay cần trợ giúp, Quý khách hàng vui lòng liên hệ thông tin dưới đây để được hỗ trợ nhanh chóng:
Hotline:
0935 069 459
Email:
Xem thêm: Lập trình tân binh | 2.6. Lớp và con trỏ
Source: https://final-blade.com
Category : Kiến thức Internet
